Cell 重磅！补齐基因编辑技术蓝图最后一块拼图，开发出线粒体基因编辑新工具

韩国基础科学研究所基因组工程中心（Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science）的研究人员开发了一种新的基因编辑平台，称为转录激活因子样效应物相关脱氢酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，缩写为TALED）。TALED 是能够在线粒体中精确进行 A 到 G 碱基转换的碱基编辑器。这一发现是长达数十年治愈人类遗传疾病之旅的结晶，而 TALED 可以被认为是基因编辑技术蓝图中的最后一块拼图。基础科学研究所的William I. Suh 表示：“我相信TALED的意义可以与2014年获得诺贝尔奖的蓝色LED的发明相媲美，就像蓝色LED作为三原色光LED中最后一块拼图使我们能够拥有高能效的白光LED光源，预计TALED的应用将迎来基因组工程的新时代。” 该研究成果于2022年4月25日，以题名“Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases”在线发表在《cell》杂志。

从 1968 年第一个限制性内切酶的发现、1985 年聚合酶链式反应 (PCR) 的发明到 2013 年 CRISPR 介导的基因组编辑的成功应用，生物技术的每一个新突破发现都进一步提高了人们对DNA的操纵能力。特别是，近些年开发的 CRISPR-Cas 系统，允许对活细胞进行更全面更精准的基因组编辑。这为通过编辑基因组中的突变来治疗以前无法治愈的遗传疾病开辟了新道路。

然而，虽然基因编辑在细胞的核基因组编辑上基本是成功的，但科学家们在编辑线粒体基因组DNA（mtDNA）方面屡屡受挫。线粒体，即所谓的“细胞发电站”，是细胞中的微小细胞器，可作为能量产生工厂。由于它是能量代谢的重要细胞器，如果基因发生突变，就会导致与能量代谢相关的严重遗传疾病。mtDNA遗传自母系，mtDNA 中有 90 种已知的致病点突变，平均每5000个人里，就有一个人患上线粒体点突变导致的遗传病。由于向线粒体内递送基因编辑系统方面的限制，许多现有的基因组编辑工具无法使用。例如，CRISPR-Cas 平台不适用于编辑线粒体基因组中的这些突变，因为引导RNA（gRNA）本身无法进入细胞器。

基因组工程中心主任 KIM Jin-Soo 解释说：由于mtDNA 的突变，会出现一些非常严重的遗传性疾病。例如，导致双眼突然失明的 Leber 遗传性视神经病变 (LHON) 是由mtDNA 中的一个简单单点突变引起的。另一种与线粒体基因相关的疾病包括伴有乳酸酸中毒和中风样发作的线粒体脑肌病 (MELAS)，它会缓慢地破坏患者的大脑。一些研究甚至表明，mtDNA 异常也可能是阿尔茨海默病和肌肉萎缩症等退行性疾病的病因。

针对上述疾病开发治疗方法，面临的另一个问题是缺乏这些线粒体疾病动物模型，因为目前缺乏有效的线粒体基因组编辑工具，不可能设计出创建动物模型所需的线粒体基因组突变，缺乏动物模型使得上述线粒体基因突变疾病的治疗方法的开发变得非常困难。

因此，编辑mtDNA的有效技术是基因组基因编辑工程的最后前沿领域之一，世界上一些最优秀的科学家多年来一直在努力使其成为现实。

2020 年，由哈佛大学Broad研究所的刘如谦教授（ David R. LIU ）团队创建了一种新的碱基编辑器，名为DdCBEs (DddA-derived cytosine base editors)，可以将mtDNA中的C转换为T，即C-to-T转换。然而，这种技术也有其局限性。它并不是针对mtDNA中所有 C-to-T 转换，而且主要限于 TC 碱基对中C-to-T 转换，严格的说是有效的 TC-TT 碱基转换器。这意味着它只能纠正 90 个已知的致病性线粒体点突变中的 9 个。长期以来，人们认为线粒体 DNA 的 A 到 G 转换是不可能的。

文章第一作者 CHO Sung-Ik 说：“我们创建一个名为 TALED 的新型基因编辑平台，可以实现mtDNA中A到G的转换，该碱基编辑器极大地扩展了线粒体基因组编辑的范围。这不仅可以为建立疾病模型奠定了基础，还将有望成为有效的线粒体遗传病治疗手段。” 值得注意的是，仅能够在人类 mtDNA 中进行 A 到 G 转换就可以纠正 90 种已知致病突变中的 39 种（占比 43%）。

TALED主要由3种功能不同的成分构成。第一个成分是转录激活因子样效应物 (transcription activator-like effector，TALE)，是一种DNA结合蛋白，能够靶向特异的DNA序列，TALE通过线粒体定位信号进入线粒体后能够与特定的线粒体DNA序列结合。第二个成分是 TadA8e，一种促进 A 到 G 转换的腺嘌呤脱氨酶，实现mtDNA中A-G碱基的转换。第三个成分 DddAtox是一种胞嘧啶脱氨酶，它使mtDNA 更容易被TadA8e编辑。

基因组工程中心主任 KIM Jin-Soo 表示：TALED的开发很有创意性，因为TadA8e是一种已知仅对单链DNA起作用的编辑器，以前没有人想过使用 TadA8e 对线粒体进行碱基编辑，因为它应该只针对单链DNA，mtDNA是双链的。正是这种跳出传统框架的思维方式真正帮助他们开发出了TALED。

研究人员推测，DddAtox使得双链DNA可以短暂地解开，而TadA8e正是抓住了这个转瞬即逝的时间窗口，快速进行对应的碱基编辑。

通过调整TALED的组件，研究人员还开发了一种能够同时进行 A-to-G 和 C-to-T 碱基编辑以及仅能能够进行 A-to-G 碱基编辑的技术。

此外，研究人员发现TALED既没有细胞毒性，也不会导致mtDNA不稳定。细胞核DNA中没有不良的脱靶编辑，mtDNA 中的脱靶效应也很少。研究人员现在的目标是通过提高编辑效率和特异性来进一步改进TALED，最终为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者中引发疾病的mtDNA突变铺平道路。该小组还专注于开发适用于叶绿体DNA中A到G 碱基编辑的TALED技术。

参考资料来源：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.039

https://www.eurekalert.org

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